奶牛流产胎儿弯曲菌的分离鉴定

作者: 疾病防治  发布:2020-01-19

  

牛生殖道弯曲菌病(bovine genital campylobacteriosis)是由胎儿弯曲菌引起的一种以不育、胚胎早期死亡及流产为特征的传染病。胎儿弯曲菌是一种微需氧的革兰氏阴性菌,分为胎儿亚种(c.fetus subsp. fetus)和性病亚种(c. fetus subsp. venerealis)。胎儿亚种引起牛散发性流产和羊地方流行性流产,也可感染人,引起流产、早产、败血症以及类似布鲁氏菌病的症状。性病亚种是牛生殖道弯曲菌病的病原,主要引起不育、胚胎早期死亡及流产,给奶牛业造成严重的经济损失。mcfaydean and stockman于1913年自流产绵羊胎儿体内分离出某些生物学特性与弧菌相似的细菌,1919年smith taylor将其命名为胎儿弧菌(vibrio fetus)。1957年king将不同来源的微需氧弧菌按培养温度不同而分为两个群,即25~37℃生长、42℃不生长者为胎儿弧菌;25℃不生长,37℃及42℃生长者为相关弧菌。1973年sebald和veron发现这些微需氧弧菌不发酵葡萄糖,dna组成及含量不同于弧菌属,为了区别于弧菌而采用了弯曲菌?(campylobacter)?这一名称。胎儿弯曲菌是弯曲菌属中得一员。到目前为止,在欧洲、美洲、澳洲和非洲均有胎儿弯曲菌分离和致病的报道,尤其在澳大利亚、南非、美国和前苏联。东南亚的印度、斯里兰卡、印度尼西亚、日本等也有报道。但国内未见胎儿弯曲菌分离的报道。2001年6月,黑龙江省牡丹江市某奶牛场饲养700余头奶牛,怀孕母牛陆续发生流产。1个月后,采集流产母牛血清用布鲁氏菌病抗原作试管凝集试验,其结果均为阳性。因此对全群母牛用布鲁氏菌病m5号菌苗进行免疫接种,之后流产现象虽然有所缓解,但至今仍不断发生,流产率约为14%。流产后因胎衣不下引起的子宫内膜炎、长期不孕和其他严重的子宫疾病而淘汰的奶牛已180余头。根据以上情况,我们对该群奶牛流产的病原进行了分离,经鉴定为胎儿弯曲菌性病亚种。报告如下。?

  

材料与方法

  

1.1 材料

  

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1.1.1 病料 为无菌采取的流产病牛子宫内容物及流产胎儿真胃内容物。

  

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1.1.2 细菌分离培养基 按陈天寿等介绍的方法制备营养琼脂、10%兔鲜血琼

  

脂、巧克力琼脂及改良布氏琼脂培养基等。

  

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1.1.3 试验用动物及鸡胚 体重为16~20g的健康小鼠由牡丹江医学院实验动物中心提供。种蛋由鸡西市发电厂农场养殖厂提供,自行孵化至12天的鸡胚用于试验。?

  

1.1.4 药敏纸片 由杭州市天和微生物试剂有限公司生产。

  

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1.2 方法?

  

1.2.1 病料涂片镜检 以无菌采取的流产牛子宫内容物及流产胎儿真胃内容物直接涂片,分别做革兰氏染色和科兹洛夫斯基氏染色,镜检。

  

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1.2.2 细菌分离 将病料分别接种于营养琼脂培养基和10%兔鲜血琼脂培养基,在需氧、厌氧条件下37℃培养24h;接种改良布氏琼脂培养基,在10% co2条件下37℃培养2周;同时种10%兔鲜血琼脂培养基、巧克力琼脂培养基,在85% n2、10% co2和5% o.2的微需氧条件下25℃培养48h。观察细菌生长情况。

  

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1.2.3 细菌纯培养 从初次分离培养的平板上挑取可疑菌落进行涂片镜检及初步鉴定,如果细菌为弯曲的杆状、革兰氏染色阴性、氧化酶和过氧化氢酶阳性、呈螺旋或投标式运动,则进行纯分离培养。?

  

1.2.4 细菌鉴定?

  

1.2.4.1 呼吸需求试验 将细菌纯培养物重新接种于10%兔鲜血琼脂培养基,分别在需氧和10% co2条件下37℃培养48 h;在含85% n2、10% co2和5% o2的微需氧条件下25℃培养48h,观察细菌的生长情况。

  

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1.2.4.2 生长试验 甘氨酸生长试验、nacl生长试验、胆汁生长试验以及温度生长试验按参考文献进行。将分离菌株接种于培养基后,在微需氧条件下培养72h,观察纪录结果。?

  

1.2.4.3 生化试验 氧化酶、过氧化氢酶试验按何晓青等介绍的方法进行。硫化氢产生试验:三糖铁接种法按参考文献介绍的方法进行;醋酸铅纸条法按参考文献介绍的方法进行。其他生化试验均按常规方法进行。分离菌株接种培养基后置25℃微需氧条件下培养48~72h,观察纪录结果。

  

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1.2.4.4 运动力检查 将无菌生理盐水滴于载玻片上,挑取纯培养的单个菌落,于盐水中混匀后加上盖玻片,在油镜下观察运动性。?

  

1.2.5 药物敏感试验 将血平板上的纯培养物用生理盐水洗下,适当稀释,吸取0.2 ml滴于血平板上,用l棒涂平,贴上药敏纸片,置于25℃微需氧条件下培养48 h。?

  

1.2.6 动物感染试验?

  

1.2.6.1 小鼠接种试验 用生理盐水将血平板上的培养物洗下,混匀。选择16-20g小鼠8只,分别于尾静脉、腹腔各接种2只,每只接种细菌约1010cfu/ml,同时分别以生理盐水作为对照,观察1周。

  

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1.2.6.2 鸡胚接种试验 用生理盐水将血平板上的培养物洗下、混匀,以原液5倍、10倍稀释菌液分别接种于12日龄的鸡胚尿囊腔,每个稀释度接种4枚鸡胚,每胚接种0.1 ml,同时以生理盐水作对照。然后于37℃继续孵化。每天照蛋,24h以内死亡鸡胚弃去,24 h以后死亡鸡胚取出,直至第5天,全部取出。观察并记录鸡胚情况。?

  

2 结果 ?

  

2.1 涂片镜检结果 用病料直接涂片,以科兹洛夫斯基氏染色后,未见红色球状或短杆状细菌。病料及纯培养物革兰氏染色涂片镜检均可见逗点形、s形、海鸥展翅形和少数螺旋形的无芽孢革兰氏阴性杆菌。

  

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2.2 分离培养结果 在需氧、厌氧、10% co2培养条件下均未见疑似细菌生长;但在含85% n2、10% co2和5% o2的微需氧条件下25℃培养48h后,血琼脂培养基、巧克力培养基上均可见光滑、圆形、半透明、微隆起、直径1mm的黄褐色菌落。菌落不溶血,经纯培养后,菌落呈薄膜状融合生长。?

  

2.3 细菌鉴定结果

  

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2.3.1 呼吸需求试验结果 分离菌株在需氧和10% co2条件下37℃培养48h,均未见生长;但在85%氮气、10% co2和5% o2的微需氧条件下25℃培养48h,生长良好。

  

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2.3.2 生长试验结果 分离菌株在微需氧条件下25℃生长,42℃不生长;在含1%甘氨酸、3.5% nacl、1%胆汁的巯基乙酸肉汤中不生长。

  

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2.3.3 运动力检查结果 镜检可见菌体运动性很强,多呈螺旋运动,少数为快速投镖式运动。

  

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2.3.4 生化试验结果 分离菌株氧化酶和过氧化氢酶阳性;在三糖铁培养基上不产生h2s,醋酸铅纸条法产生h2s;不还原亚硝酸盐;不水解马尿酸钠;不水解七叶苷,不使苯丙氨酸脱氨,不利用丙二酸盐;在含1%甘氨酸、3.5% nacl、1%胆汁的巯基乙酸肉汤中不生长;在微需氧条件下,25℃生长,42℃不生长。?

  

2.4 药敏试验结果 对分离菌株进行药敏试验结果:卡那霉素、红霉素、恩诺沙星、丁胺卡那霉素、洛美沙星、庆大霉素、氟哌酸、环丙沙星、萘啶酮酸和头孢噻吩高敏;青霉素、链霉素中敏;复方新诺明、四环素不敏感。?

  

2.5 动物感染试验结果

  

小鼠经尾静脉和腹腔接种后观察1周,均无发病和死亡。鸡胚接种试验中,接种细菌原液的鸡胚均于24h死亡,其头和爪有少量出血;接种5倍稀释菌液的鸡胚有1枚于接种24h后死亡,头、腿有明显出血,其余3枚于接种24h以内死亡;接种10倍稀释菌液的鸡胚和对照鸡胚均正常。?

  

3 讨论

  

3.1 本试验在85% n2、10% co2和5% o2的微需氧条件下分离获得了革兰氏染色阴性菌,呈逗点形、s形和螺旋形;螺旋式或投标式运动;氧化酶及过氧化氢酶阳性;在25℃及37℃微需氧条件下生长良好;在三糖铁培养基上不产生h2s,醋酸铅纸条法产生h2s;不还原亚硝酸盐等,符合胎儿弯曲菌的特性。再根据分离菌株在含1%甘氨酸的巯基乙酸肉汤中不生长的特性将本次分离菌株确定其为胎儿弯曲菌性病亚种。其他试验,如亚硝酸盐还原、头孢哌酮仅可作为参考。另有研究表明,所有胎儿弯曲菌胎儿亚种和大多数性病亚种对萘啶酮酸耐受,除了少部分胎儿亚种外所有的胎儿弯曲菌对头孢噻吩敏感,而我们获得的分离菌株对萘啶酮酸、头孢噻吩均敏感。?

  

3.2 胎儿弯曲菌性病亚种除可引起怀孕母牛流产和不育外,对豚鼠、仓鼠和鸡胚有致病性,但经腹腔注射对兔、小鼠和大鼠不致病。我们对分离菌株的动物感染试验结果表明,该菌对小鼠无致病性,对10~12日龄鸡胚有一定致病性。本次试验我们对流产母牛阴道分泌物及胎儿胃内容物进行涂片,作科兹洛夫斯基氏染色镜检,未发现红色的球状或短小的杆菌;同时,病料接种改良布氏琼脂培养基,培养2周未见布鲁氏菌疑似菌株生长,由此表明由布鲁氏菌感染造成母牛流产的可能性很小,而且该牛群接种布鲁氏菌病m5号苗后仍发生流产。根据这些情况及病原分离鉴定结果可以判定该牛场所发生的免疫母牛持续流产是由胎儿弯曲菌所引起的牛生殖道弯曲菌病。而且用分离菌株制成灭活菌苗给该牛群进行免疫接种,已使牛群的流产现象得到了很好地控制。

  

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3.3 目前,在全省乃至全国范围内对牛布鲁氏菌病采取检疫、隔离及淘汰等综合性防制措施,基本上得到了有效地控制。然而,近几年有些奶牛场妊娠母牛暴发流产、死胎、胎衣不下、子宫内膜炎和不育等繁殖障碍性疾病。据我们调查了解,在我省牡丹江以东的布鲁氏菌病基本得到净化的一些农场的部分牛场,近年来不断出现妊娠母牛发生流产现象,且布鲁氏菌抗体为阴性。这种情况有可能是胎儿弯曲菌所致,因此,有必要对本病进行全面调查和系统研究,以便有效地加以防制。

  

 

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